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组培污染的途径,症状及对策(组培污染率高的原因)

组织培养室的污染源一般可分为以下几个方面:接种前污染、接种中污染、接种后污染、母体细菌感染。

1、接种前污染:培养基消毒不彻底

组培污染的途径,症状及对策(组培污染率高的原因)

一、现象

如果培养基消毒不彻底,污染通常以培养皿内部的盘状出现,但也可能出现在培养基表面或瓶壁、瓶盖表面。

2. 原因

原因可能是灭菌锅受热不均匀、培养基过多、瓶子没有清洗干净等。

3. 回应

通过取几批培养基放置12周,观察污染的发生情况,可以对灭菌成功率做出适当的评价。将培养基放置一周左右再使用,可以实时监测灭菌成功率,有较大的缓冲时间来应对灭菌锅故障等突发情况。

2、疫苗接种过程中污染:员工操作或相关灭菌设备故障

一、现象

污染是在接种过程中造成的。污染物通常靠近培养物生长,但在极少数情况下,污染物也可能随机散布在培养基表面。

2. 原因

其原因包括员工操作不符合无菌操作要求、超净工作台高效过滤器失效、超净工作台风速过低、超净工作台表面不洁净等。未进行消毒,接种设备消毒不彻底。组培工厂一般员工的污染率通常在3%左右,但当技术人员进行严格的接种操作时,污染率可以控制在1%以下。如果组织培养工厂内接种人员的污染率存在巨大差异,我们应该从“接种时污染”的角度来寻找解决方案。

3. 回应

应对措施一般包括定期测试机器的过滤效果、测试机器的气流大小、规范员工操作、测试高温消毒器、测试铁板或纸片的消毒效果等。

3、接种后污染:培养过程中气流或小动物造成的污染

一、现象

污染物通常扩散到培养基表面,而不是在培养物上生长。有时,当引入螨虫或蓟马等小动物时,瓶子中仍然可以看到微小的爬行虫子。此时,真菌污染物可能从瓶盖或瓶壁向下生长,或者可能在培养基中。表面生长出弯曲的轨迹(沿着爬行昆虫的轨迹生长)。如果有螨虫污染,可以在瓶壁上观察到蜘蛛网状的细丝。

2. 原因

原因可能是培养室洁净度差,气流快,导致灰尘较多;缓冲不良会使蓟马飞入;培养室人员衣着不当,导致螨虫增多;或者没有对污染进行定期监测,使虫子造成的污染有机会传播。

3. 回应

首先,要查清污染源。如果您发现污染迹象从一个瓶子蔓延到另一个瓶子,很可能是虫子造成的污染。应立即拧紧受污染的瓶盖并清除受污染的瓶子。平时要注意培养室的缓冲作用,员工服装要规范,培养室要定期清洁,比如每周拖地两次。培养室可设置每晚臭氧消毒。最有效的措施是定期检查和清除污染物。

4.关于螨虫污染

在这里我想补充一下我个人的看法。在一般清洁的养殖环境中,螨虫会随机出现。毕竟人体里是有螨虫的。

当观察到螨虫污染时,更多未观察到的母瓶已经被污染。由于螨虫从瓶口爬到培养基上,因此在真菌菌落生长之前,在此阶段无法观察到螨虫。当一篮子材料严重污染时,应立即丢弃整个篮子。

瓶口螺旋处有螨虫无法进入瓶内。这样的母瓶在旋转之前总是干净的,但是旋转之后就会发生污染。

可能有少量没有霉菌孢子的螨虫进入了瓶子,无法观察到。这些母瓶很容易被忽视,成为隐藏的感染源。当螨虫在瓶内繁殖并进出瓶口时,最终会发生真菌污染。

为了控制螨虫污染,筛查是最重要的措施,而农药的效果尚不明确。每3至7天应进行一次筛查操作,直至整个培养室的螨污染率降至0.1%以下。然后每周彻底清理霉菌污染,直到没有发现疑似螨虫污染为止。

当螨虫爆发时,往往是由于管理不善造成的。此时,只有部分瓶子明显受到污染。更多的瓶子有螨虫,但不易观察到。因此,即使在发现螨虫爆发后立即清洗受污染的瓶子,未来污染仍会继续增加。通过持续筛查,污染量在达到峰值后会逐渐减少,整个“螨病病程”预计将持续2至3个培养周期。如果应对措施良好,三个周期后螨虫数量应控制在正常水平,但此后还应有持续的监测措施。

4、带菌母本:组织培养物本身含有内生菌,或外植体消毒时保留微带菌物质。

一、现象

这种类型的污染必须从靠近培养物表面开始。由于这种类型的污染可以在细菌组织培养中保留和进行,因此它通常生长缓慢并且很难在培养基中观察到丝状体。但随着培养代数的增加,污染物的生长速度也可能会变快,污染会变得更加明显(原因可能是经过很长一段时间,细菌发生了快速生长突变,进而占据了生长优势) )。

2. 原因

一般来说,植物或多或少地含有内生菌。轻微污染不易察觉,不影响培养物生长,且易于保留。

3. 回应

对于内生菌问题,尝试使用不含内生菌的材料,包括茎尖解毒。从同一批母本获得的培养物也可能含有少量不含内生菌的物质。部分材料经过精心挑选用于繁殖,其余材料可用于数代。如果内生菌没有影响组织培养物的生长,则可以忽略它们。

在轻微污染的情况下,从一开始就应尽可能仔细地选择无菌材料进行集中繁殖。当然,适当的接种操作也可以将轻微污染控制在可控范围内,例如每次转瓶时清除所有旧组织,仅使用新组织进行繁殖或羽化。